| Η εξέταση Παπανικολάου (Pap test) |
| Λήψη δείγματος |
| Οδηγίες για την οργάνωση του εργαστήριου, επεξεργασία, και προληπτικός έλεγχος (screening) |
| Ορολογία και κυτταρολογική έκθεση. |
Οδηγίες για την οργάνωση του εργαστηρίου, παρασκευαστική διαδικασία και προληπτικός έλεγχος (screening).
- Το δείγμα με το αντίστοιχο παραπεμπτικό λαμβάνονται από το εργαστήριο
- Προσδίδεται αριθμός αναφοράς του εργαστηρίου
- Η ταυτότητα του ασθενούς και ο αριθμός αναφοράς του επιχρίσματος καταγράφονται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή.
- Τα επιχρίσματα βάφονται, επικαλύπτονται και αποκτούν αναγνωριστική ετικέτα.
- Τα πλακίδια ελέγχονται προσεχτικά από κυτταροτεχνολόγους πρωτοβάθμιας εκπαίδευσης.
- Όλα τα πλακίδια ελέγχονται ξανά από κυτταροτεχνολόγους δευτεροβάθμιας εκπαίδευσης, και αυτά που έχουν άτυπα κύτταρα παραπέμπονται στον ιατρό κυτταρολόγο.
- Η τελική κυτταρολογική έκθεση ετοιμάζεται και αποστέλλεται στο τμήμα που έγινε η λήψη του επιχρίσματος.
- Η ασθενής ενημερώνεται για τα αποτελέσματα του τεστ
- Ανάλογη δράση λαμβάνεται σε περίπτωση προβληματικού αποτελέσματος.
Τμήμα υποδοχής των κυτταρολογικών υλικώ
- Στο τμήμα υποδοχής του εργαστηρίου το επίχρισμα και το παραπεμπτικό πρέπει να ελεγχθούν για να επιβεβαιωθεί η αντιστοιχία. Και στα δύο (πλακίδια και έντυπο) προσδίδεται ο ίδιος αριθμός αναφοράς του εργαστηρίου ή γραμμωτός κωδικός (barcode).
- Τα πλακίδια πρέπει να προετοιμαστούν για να βαφτούν με την μέθοδο Παπανικολάου.
- Μετά την χρώση στο πλακίδιο τοποθετείται DPX και καλυπτρίδα (βέλτιστο μέγεθος 22x50 mm).
- Πρέπει να δωθεί χρόνο στo DPX να στεγνώσει πριν να σταλεί το πλακίδιο μαζί με το παραπεμπτικό για κυτταρολογικό έλεγχο.
Η χρώση Παπανικολάου
Μετά από πολλά χρόνια πειραματισμών, ο Δρ Παπανικολάου ανέπτυξε την τρίχρωμη χρώση η οποία επέζησε, με μικρή μόνο τροποποίηση, ως τις μέρες μας, και είναι η χρώση επιλογής για κυτταρολογικό υλικό. (Παπανικολάου 1942 :Νέα μέθοδος χρώσης κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, Science 95, 438). Για καλύτερα αποτελέσματα τα επιχρίσματα δεν πρέπει να στεγνώσουν πριν την μονιμοποίση ή κατά την διάρκεια της μεθόδου.
Χρώση Παπανικολάου
Procedure Time Comment Remove polyethylene glycol carbowax fixative In 50% alcohol 2 min's Failure to remove carbowax will result in artifact which obscure the cells & is difficult to remove Rinse in water
1 min's Ensure re hydration is complete Stain in Harris Haematoxylin 5 min's Staining time will depend on formula of haematoxylin Rinse in water 2 min's Unbound haematoxylin is removed Differentiate in 0.5% aqueous hydrochloric acid 10-20 sec's Rinse in tap water 2 min's Blue in Scott’s tap water substitute 1 min's The brown colour of acid haematin is changed to blue/ black by weak alkaline solution Rinse in water 2 min's Wash thoroughly to remove alkaline salts Dehydrate 70%alcohol 2 min's Dehydrate through graded alcohols Dehydrate 95%alcohol 2 min's Dehydrate 95%alcohol 2 min's Stain in Orange G6 (OG6) 2 min's Rinse in 95%alcohol 2 min's Rinse in 95% alcohol 2 min's Rinse in 95% alcohol 2 min's Stain in Gills EA30 solution 3 min's Rinse in 95% alcohol x3 1 min Clear in xylene x3 and mount in DPX
1 min Leave in xylene until ready to mount in DPX Αποτελέσματα χρώσης:
- Πυρήνας- μπλε μαύρο
- Κυτταρόπλασμα (μη κερατινοποιούμενο)- μπλέ και εξασθενημένο κόκκινο
- Κύτταρα του αίματος- πράσινο
- Κυτταρόπλασμα (κερατινοποιούμενο)- ροζ
- Ερυθρά αιμοσφαίρια-πορτοκαλί
Το τελικό αποτέλεσμα θα πρέπει να διατηρεί την διαπερατή ποιότητα του κυτταροπλάσματος και η δομή της χρωματίνης του πυρήνα πρέπει να διακρίνεται καθαρά.
Σχόλια για την χρωστική μέθοδο Παπανικολάου
Η χρώση Παπανικολάου είναι μία πολύχρωμη χρωστική μέθοδος η οποία αποτελείται από μία πυρηνική χρώση (αιματοξυλίνη) και δύο εξουδετερωτικές χρώσεις (Orange G και EA). Απαιτείται ενυδάτωση των μονιμοποποιημένων επιχρισμάτων, ώστε τα κύτταρα να απορροφήσουν την αιματοξυλίνη, ενώ η αφυδάτωση προετοιμάζει τα κύτταρα για να δεχθούν τις εξουδετερωτικές χρώσεις. Τροποποίηση της χρώσης είναι συχνή καθώς το κάθε εργαστήριο προτιμάει την δική του ισορροπία χρωμάτων. Οι διάφορες ρυθμίσεις γίνονται αλλάζοντας την διάρκεια χρόνου στην αιματοξυλίνη και την χρώση ΕΑ. Άλλοι παράγοντες οι οποίοι μπορεί να επηρεάσουν την ισορροπία χρωμάτων είναι η χημική σύνθεση του νερού της βρύσης, η θερμοκρασία, το pH του δείγματος και ο αριθμός των πλακιδίων ανά «παρτίδα» για χρώση. Εάν οι λεπτομέρειες του πυρήνα διακρίνονται καθαρά και η διαπερατότητα του κυτταροπλάσματος διατηρείται, οι διαφορές στην χρώση ανάμεσα στα διάφορα εργαστήρια είναι αποδεκτές. Εντούτοις κάθε εργαστήριο θα πρέπει να σταθεροποιήσει την διαδικασία της χρωστικής μεθόδου ώστε τα αποτελέσματα του εργαστηρίου να διέπονται από συνέπεια.Η χρωστική μέθοδος Παπανικολάου μπορεί να είναι προοδευτική ή οπισθοδρομική.
Στην προοδευτική μέθοδο η ένταση της βαφής του πυρήνα ελέγχεται από την εμβάπτιση του πλακιδίου σε έναν ‘μπλέ’ παράγοντα, αφού ο πυρήνας έχει χρωσθεί στην απαιτούμενη ένταση με αιματοξυλίνη. Οι ‘μπλε’ παράγοντες που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι το Scott’s υποκατάστατο του νερού της βρύσης (pH 8.02), το υδροξείδιο του αμμωνίου και το ανθρακικό λίθιο. (Το νερό της βρύσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί εάν το pH είναι κατάλληλο). Η προοδευτική μέθοδος προσδίδει στο κυτταρόπλασμα μία πολύ ελαφριά απόχρωση.Στην οπισθοδρομική χρώση, ο πυρήνας είναι σκοπίμως υπερχρωσμένος με μη-οξειδοποιημένη αιματοξυλίνη. Η παραπάνω χρώση απομακρύνεται με αραιωμένο διάλυμα υδροχλωρικού οξέος. Το οξύ απομακρύνεται με εμβάπτιση του πλακιδίου σε τρεχούμενο νερό βρύσης. Η διάρκεια είναι σημαντική στην οπισθοδρομική χρώση καθώς το αποτέλεσμα μπορεί να είναι ένας υποχρωματικός παρά ένας υπερχρωματικός πυρήνας. Το κυτταρόπλασμα αποχρωματίζεται τελείως από το όξινο διάλυμα. Η αιματοξυλίνη Harri’s συνήθως χρησιμοποιείται στην οπισθοδρομική χρωστική μέθοδο. Η αιματοξυλίνη Gill’s ή Mayer’s συνήθως χρησιμοποιείται στην προοδευτική χρωστική μέθοδο.
Η Orange G είναι μία όξινη χρώση η οποία βάφει ροζ χρώμα τις βασικές πρωτεΐνες όπως είναι η προκερατίνη. Η Orange G επίσης έχει ισχυρή συγγένεια με την κερατίνη την οποία χρωματίζει έντονο πορτοκαλί.
EA είναι μία πολυχρωματική χρώση η οποία είναι συνδυασμός ανοιχτού πράσινου, SF κίτρινου και εωσίνης Y. Χρωματίζει το κυτταρόπλασμα των μεταβολικά δραστήριων κυττάρων (όπως τα παραβασικά κύτταρα, τα διάμεσα κύτταρα, τα λευκοκύτταρα και τα ιστιοκύτταρα, όπως επίσης και τα καρκινικά κύτταρα) με ένα ελαφρύ πράσινο χρώμα.
Εντούτοις, η ισορροπία χρωμάτων σε ένα πλακίδιο που έχει βαφτεί κατά Παπανικολάου εξαρτάται όχι μόνο από την χρωστική μέθοδο αλλά και από την εμπορική προέλευση των χρώσεων και το pH του κυτταρικού δείγματος. Κατά συνέπεια η χρώση Παπανικολάου δεν μπορεί να θεωρηθεί μία ακριβής στοιχειομετρική χρώση, αν και αναφέρεται ότι η σχέση μεταξή των υλικών που έχουν βαφτεί κατά Παπανικολάου και κατά Feulgen είναι πολύ μεγάλη.For further information about the Papanicolaou stain and general cytopreparatory techniques please consult Chapter 34 , Cytopreparatory Techniques by CM Keebler in Comprehensive Cytopathology (1996) editor M Bibbo pub Saunders
Προληπτικός έλεγχος και κυτταρολογική έκθεση
- Θα πρέπει να υπάρχουν ένα πρωτόκολλο προληπτικού ελέγχου (screening), μέτρα που εξασφαλίζουν τον ποιοτικό έλεγχο και κατάλληλο προσωπικό με σωστή κατανομή εργασιών.
- Με στόχο να αποκτήσουν εμπειρία είναι σημαντικό οι κυτταροτεχνολόγοι να βλέπουν ένα μεγάλο εύρος περιπτώσεων. Τα εργαστήρια θα πρέπει να διεκπεραιώνουν τουλάχιστον 15.000 κολποτραχηλικά επιχρίσματα το χρόνο και ο κάθε κυτταροτεχνολόγος θα πρέπει να κάνει έλεγχο σε 50-80 επιχρίσματα την ημέρα με διαλείμματα ανά ώρα. Ο κυτταροτεχνολόγος πρέπει να έχει το δικό του χώρο εργασίας με το μικροσκόπιό του.
- Τα έτοιμα πλακίδια/ περιστατικά θα πρέπει να ελέγχονται με τον 10x αντικειμενικό μεγενθυντικό φακό και 10x ή 12x προσοφθάλμιο. Ο ίδιος αντικειμενικός φακός χρησιμοποιείται για όλο το πλακίδιο (slide). Πρέπει να καλυφθούν όλα τα οπτικά πεδία που βρίσκονται κάτω από την καλυπτρίδα. Είναι σύνηθες να ξεκινάει ο έλεγχος από την μία γωνία του πλακιδίου και να προχωράει βήμα-βήμα μέχρι να καλυφθεί όλη η επιφάνεια όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα.
- Έχει υπολογιστεί ότι, χρησιμοποιώντας αντικειμενικούς φακούς μικρής μεγέθυνσης, θα εξεταστούν 250-300 πεδία κατά την διάρκεια ελέγχου ενός μόνο πλακιδίου. Ο μέσος χρόνος για να ολοκληρωθεί αυτή η διαδικασία είναι 6-10 λεπτά (όρια: 5-20 λεπτά).
- Για να σημαδευτούν τα κύτταρα που παρουσιάζουν ενδιαφέρον, ο 4x αντικειμενικός φακός χρησιμοποιείται. Ένα πρωτόκολλο σημάδευσης των κυττάρων πρέπει να υπάρχει στο εργαστήριο.
- Για έλεγχο των περιοχών που παρουσιάζουν ενδιαφέρον ο 20x ή 40x πρέπει να χρησιμοποιείται.
- Το παραπεμπτικό και το ιστορικό του κολποτραχηλικού ελέγχου πρέπει να παρέχεται με κάθε επίχρισμα και να ελέγχεται από τον κυτταρολόγο πριν την εξέταση του επιχρίσματος.
Ορολογία και αρχές για την παροχή αποτελέσματος των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.
- Η κυτταρολογική έκθεση πρέπει να είναι ακριβής και συνοπτική, ώστε το περιεχόμενό της να είναι εύκολα κατανοητό από ολόκληρο το προσωπικό που εργάζεται στον προληπτικό έλεγχο.
- Είναι γενικά παραδεκτό ότι η κυτταρολογική έκθεση γίνεται περισσότερο κατανοητή όταν είναι γραμμένη σε ελεύθερο κείμενο αφηγηματικής μορφής, ενώ οι σύντομες μικρές εκθέσεις είναι εύκολο να παρερμηνευτούν. Για αυτόν τον λόγο, πολυάριθμα αριθμητικά συστήματα κατάταξης, συμπεριλαμβανομένου και αυτού που πρότεινε ο Παπανικολάου (1954) δεν προτείνονται ως κατάλληλα.
Υπάρχουν πέντε συνιστώντα μέρη της κυττρολογικής έκθεσης
- Ο τύπος του δείγματας π.χ. τραχηλική απόξεση, ενδοτραχηλική ψήκτρα, ή δείγμα LBC, πρέπει να αναφέρεται.
- Πρέπει να σχολιάζεται η επάρκεια του δείγματος δηλ. αν το δείγμα είναι κατάλληλο για αξιολόγηση.
- Η έκθεση πρέπει να περιγράφει με συντομία τα κυτταρολογικά ευρήματα με όρους που χρησιμοποιούνται ευρέως και είναι κατανοητοί.
- Στις περιπτώσεις που τα κυτταρολογικά ευρήματα είναι άτυπα οι πιθανές παθολογικές αλλοιώσεις του τραχήλου πρέπει να προβλεφθούν.
- Ένα πέμπτο μέρος της έκθεσης συμπεριλαμβάνει υποδείξεις για αντιμετώπιση αλλά αυτό είναι προαιρετικό.
- Ο κυτταρολόγος πρέπει να λάβει υπόψη του όλα τα σχετικά κλινικά δεδομένα που αφορούν τον ασθενή πριν ετοιμάσει την έκθεση αναφοράς της κυτταρολογικής εξέτασης.
- Συνιστάται εντόνως όλα τα προβληματικά επιχρίσματα να διεκπεραιώνονται από ιατρό κυτταρολόγο ή από εξειδικευμένο επαγγελματία ο οποίος έχει εκπαιδευτεί ειδικά στην γυναικολογική κυτταρολογία.
