Směrnice pro organizaci laboratoře, zpracování a screening

Stádia práce v cytologické laboratoři:

• Příjem materiálu a průvodky
• Přidělení čísla v laboratoři
• Zadání pacientky a údajů nátěru do počítače
• Barvení, montování a značení skel
• Nátěry screenovány primárním screenerem
• Všechny nátěry kontrolovány sekundárním screenerem a abnormální předány patologovi.
• Příprava zprávy a předání zadavateli.
• Informování pacientky o výsledku testu.
• Zajištění odpovídajícího postupu v případě abnormálního výsledku.

 

 

 

Příjem vzorku                                                                                       

• Při příjmu prrobíhá kontrola materiálu a prrůvodky, zda se shodují údaje. Vzorek dostává číslo vyšetření, popř. čárový kód.
• Nátěry jsou připraveny pro barvení dle Papanicolaoua
• Po obarvení jsou nátěry montovány v DPX  mediu a kryty krycím sklem  (optimální velikost 22x50mm).
• Montovací medium ponechat zaschnout. Následně kompletovat s průvodkou a odeslat k primárnímu screeningu.

 

Barvení podle Papanicolaoua

Po mnoha letech  experimentů Dr. Papanicolaou vyvinul  trichromatické barvení , které přetrvalo s minimálními modifikacemi až do současnosti a je akceptovaným barvením pro cytologické preparáty. (Papanicolaou 1942: A new procedure for staining vaginal smears Science 95,438). Pro dosažení optimálního výsledku nesmí nátěry v průběhu celé procedury oschnout- před fixací ani v průběhu barvení.

Papanicolaouovo barvení

 

#	Procedure	Time	Comment
1	Odstranit  polyethylenglykol carbowax fixativum v 50% alkoholu	2 min's	Nedostatečné odstranění carbowaxu zastře buňky a nedá se již snadno odstranit
2	Opláchnout ve vodě	1 min's	Zajistěte kompletní hydrataci
3	Barvení v Harrisově  Haematoxylinu	5 min's	doba barvení j závislá na složení hematoxylinu
4	Opláchnout ve vodě	2 min's	nenavázaný hematoxylin je odstraněn
5	Diferencovat v 0.5% vodním roztoku kys. chlorovodíkové	10-20 sec's
6	Opláchnout v tekoucí vodě	2 min's
7	Modřit v  Scottově  náhražce tekoucí vody	1 min's	Hnědá barva kyselého haematinu se mění na modrou/modročernou slabě alkalickým roztokem.
8	Opláchnout ve vodě	2 min's	Odmyjte pečlivě alkalické soli
9	Dehydratace  70% alkoholem	2 min's	Dehydratace vzestupnými alkoholy
10	Dehydratace  95% alkoholem	2 min's
11	Dehydratace 95% alkoholem	2 min's
12	Barvení  Oranží G6 (OG6)	2 min's
13	Opláchnout v 95% alkoholu	2 min's
14	Opláchnout v 95% alkoholu	2 min's
15	Opláchnout v 95% alkoholu	2 min's
16	Barvit Gillovým roztokem  EA30 solution	3 min's
17	Opláchnout v 95% alkoholu 3x	1 min
18	Projasnit v xylenu 3x a montovat v  DPX	1 min	Do montování ponechat  xylenu

Resulting stain:  

• Nuclei- blue black
• Cytoplasm- non keratinised blue and effete red
• blood cells- green
• Cytoplasm (keratinised)- pink
• Red cells- orange

Výsledek správně provedeného barvení by měl zachovat transparentní kvalitu cytoplazmy a ozřejmit chromatinovou strukturu jader. 

Poznámka k barvení dle Papanicolaoua

Papanicolaouovo barvení je polychromatické barvení, které zahrnuje jaderné barvení (haematoxylin) a dvě dobarvení (Oranží G a EA polychromem). Hydratace fixovaného nátěru je podmínkou obarvení jader haematoxylinem, zatímco dehydratace je připraví pro dobarvení. Modifikace barvení jsou obvyklé, protože  každá laboratoř preferuje vlastní odstín.  Adjustace spočívají v modifikacích časů pro  hematoxylin a EA polychrom. Dalšími faktory ovlivňujícími výsledek jsou vyvážení barev a složení tekoucí vody, teplota, pHf vzorku a počet nátěrů v barvicí lázni. Pokud je jaderný detail dobře definován a transparence  cytoplasmy je zachována, mezilaboratorní barevné variace lze akceptovat. Každá laboratoř by však měla mít reproducibilní barvicí postup.

Papanicolaouovo barvení může být  progresivní  nebo regresivní.

V  progresivní metodě je intensita jaderného barvení kontrolována ponořením do modřícího roztoku po odpovídajícím obarvení hematoxylinem. Nejobvyklejší je modřící činidlo Scottovo – náhražka tekoucí vody (pH 8.02), roztok hydroxidu amonnného a  lithiumkarbonátu. (kohoutková voda může být použita, má-li odpovídající pH). Progresivní barvení zabarvuje cytoplasmu pouze velmi lehce.

V regresivním barvení  je jádro záměrně přebarveno neokyseleným
 hematoxylinem. Přebytečné barvení je odstraněno roztokem zředěné kyseliny solné. Odbarvující kyselina je následně odstraněna ponořením do tekoucí kohoutkové vody. Podstatný je v této metodě čas, jinak může vzniknout hypochromatické jádro. Cytoplazma je rovněž zcela odbarvena. Harrisův hematoxylin je obvykle kombinován s regresivní barvicí metodou. Gillův nebo  Mayerův  hematoxylin se používá zpravidla v progresivních  barvicích metodách. Podstatné je si uvědomit, že důležitější  je pH roztoku, než to, zda je použita regresivní nebo progresivní metoda.

Orange G  je kyselé barvivo, které barví bazické proteiny jako  prekeratin růžově. Orange G má rovněž silnou afinitu pro keratin, který barví jasně oranžově. Tím se stává důležitým markerem abnormální keratinizace cervikálního a vaginálního epitelu, který se vyskytuje např. při prolapsu a infekcích virem bradavic. Je rovněž citlivým markerem dobře diferencovaného dlaždicového karcinomu hrdla. Je třeba mít oplachovací lázně čiré a často měnit barvicí roztoky,  jinak bude jaderné a cytoplazmatické barvení nedokonalé.

EA je polychromatické barvení , které je kombinací světlé zeleně, SF žluti a eozinu  Y. Barví cytoplasmu metabolicky aktivních buněk (jako např. parabazálních,  intermediárních, leukocytů a histiocytů, jakož i nádorových buněk) světle zeleně.
Nicméně, barevný výsledek metody dle Papanicolaoua je závislý nejen na použité modifikaci, ale i komerčním zdroji reagencií a pH vzorku. Nelze tedy toto barvení považovat za stoichiometrické, ačkoli korelace mezi materiály barvenými dle Papanicolaoua a  Feulgena je dle publikovaných sdělení velmi dobrá.

Pro další informace  o Papanicolaouově barvení a obecně technikách přípravy preparátů konzultujte Chapter 34 , Cytopreparatory  Techniques by CM Keebler in Comprehensive Cytopathology (1996) editor M Bibbo pub Saunders       

Screening a zpráva

• Protokol screeningu byl měl být schválen manažerem laboratoře. Musí být uplatněna hlediska kontroly kvality a pracovní zátěže screenerů.
• K získání kvalifikace je zásadní, aby cytotechnolog viděl široké spektrum případů. Laboratoř by měla zpracovávat alespoň 15,000 cervikálních stěrů ročně a každý screener by měl denně screenovat 50 -80  nátěrů s přestávkami po hodině práce. Má mít vlastní pracovní místo a binokulární mikroskop.
• Nátěry by měly být screenovány pomocí zvětšení 10x objektiv a 10x nebo  12x okuláry. Celé sklo by mělo být screenováno jedním zvětšením pole za polem s vyšetřením celé plochy pod krycím sklem. Začíná se zpravidla v rohu a sklo screenuje krok za krokem, jak znázorněno níže.

• Bylo zjištěno, že při použití malého zvětšení vyšetří  screener  250-300 polí ve screenovaném  preparátu a průměrně k tomu potřebuje 6-10 minut (rozsah 5 -20 minut)
• K označení buněk pro rescreening se používá objektiv 4x . V laboratoři by měl být zaveden protokol ke značení buněk.
• K prohlížení polí s obsahem speciálního zájmu se užívají objektivy 20x a  40x .
• S každým stěrem  musí být dodána průvodka a historie cervikálního screeningu. Před screeningem ji screener prostuduje.

Terminologie a principy popisování cervikálních stěrů.

• Cytologický nález musí být přesný a výstižný, tak aby jeho obsah byl jasně srozumitelný odběrateli vzorku a všem zdravotnickým, technickým a administrativním profesionálům angažovaným ve screeningu cervikálního karcinomu. 
• Terminologie   musí sdělovat odpovídající klinickou informaci zadavateli vyšetření. Obecně je přijímáno, že se toho docílí nejspíše , je-li zpráva psána volnou formou , protože zkratkovité nálezy jsou zdrojem možné misinterpretace. Z tohoto důvodu jsou numerické klasifikační systémy Papanicolaouova (1954) zapovídány.

 

Zpráva má pět oddílů Má být uveden typ vzorku, např. cervikální stěr, endocervikální kartáček nebo LBC . Ohodnocení adekvátnosti (kvality) vzorku, tj. zda je dostatečný pro hodnocení. Zpráva má obsahovat stručné hodnocení cytologických nálezů v obecně užívaných a srozumitelných pojmech. V případě abnormálního cytologického nálezu by měl být předpovězen předpokládaný patologický nález cervixu. Pátou nepovinnou částí nálezu je návrh dalšího postupu.

• Cytolog by měl při formulaci nálezu vzít v úvahu všechny klinické údaje o pacientce.
• Všechny abnormální stěry musí být popsány patologem nebo kvalifikovaným cytopatologem s licencí pro gynekologickou cytologii.