TEKNİK YÖNLER

1. İİA’u ve yayma hazırlama
2. Temel boyama
3. İİS materyal yönetimi ve yardımcı teknikler
4. Sitospin
5. Hücre bloğu
6. İmmünosiyokimya (İSK)
7. Akım sitometri (AS)
8. Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
9. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

İİS ve yayma hazırlama

• Palpe edilebilen  lenf nodlarının İİA’u 23-25 gauge iğne ile aspirasyon ile ya da aspirasyonsuz uygulanmalıdır. Küçük lenf nodlarında (1cm ya da daha küçük) hedefe daha yaklaşabilmek için,  aspirasyon ekipmanı olmadan,  daha kısa iğne ile yaklaşım daha kolay olabilir.
• Lenf nodunu iki parmak arasında sabitleyin; aksiller lenf nodlarında hedefi iki parmak ucuyla ''aşağı çekerek''  göğüs duvarında sabitlemeye  çalışın.
• Deri ve hedef arasındaki mesafeyi kısaltmaya çalışın ve orantısal olarak iğneyi gerekli  mesafe boyunca sokun.
• Palpe edilemeyen veya derin lenf nodlarının İİA’nunun  ultrason kontrolü altında uygulanması gereklidir. Bu durumda en kısa ve en direkt yolu seçin: yol ne kadar uzun ve ne kadar oblik ise iğnenin deviasyon riski o kadar fazla olur. İğne hareketleri sınırlıdır; lenf nodu yeterince büyükse en önemli kısmına ulaşmaya çalışın.
• Algılamalarınıza dikkat edin : deri ilk direnci , kapsül  daha az direnci gösterir; lenf noduna girildiğinde ise bir boşluğa girmişsiniz gibi hissedersiniz, eğer öyleyse hedefe ulaştınız demektir.
• İğneyi hafifçe yukarı, aşağı ve yanlara, hedefin boyutuyla orantılı bir yarıçap çizerek haraket ettirin.
• İğneyi hareket ettirirken hastanın ağrı duyup duymadığını sorgulayın, eğer ağrı varsa hedeften sapmış olabilirsiniz.
• İğnelemeyi değerlendirin: yumuşak, sert, fibröz, parçalanan vb. Bu veriler  yaymaları değerlendirirken size yardımcı olabilir.
• İğnenin 'hub' ını aspirasyon sırasında kontrol edin; materyal gelmeye başlayınca İİA’nunu durdurun ve yaymaları hazırlayın. İğne 'hub'ında kan görürseniz geçişi hemen  durdurun; kan yaymanızı bozabilir ve mikrohemoraji ikinci bir geçişi riske atabilir.
• Aspirasyonlar,  iğnelemede 'fibröz'  olgular dışında, 20-30 saniyeyi aşmamalıdır, daha uzun aspirasyonlar yararsız olabilir veya mikrohemorajiye neden olabilir.
• Aspire materyali hafifçe püskürtün; eğer küçük damlalara bölerseniz tek geçişe ait ek yaymalar hazırlayabilir ya da materyali hücre bloğu veya yardımcı teknikler için kullanabilirsiniz.
• Yayma tekniğini materyalin kalitesine göre seçin: sıvı materyal için hematolojik teknik (periferik kan vb.)  ve yoğun materyal için direkt yayma.
• Havada hemen kuruyan tek tabakalı yaymalar elde etmek için yayma yeterince hafif ve lenfositlerin morfolojilerini korumak için de yeterince nazik olmalıdır.
• Hemen Diff Quik ile  boyadığınız bir yaymayı yeterlilik açısından  ve materyali nasıl yöneteceğinize ve ek geçiş gerekliliğine karar vermek  için değerlendirin.

Back to top

Temel boyama

Diff Quik  (May-Grunwald Giemsa)   ve Papanicolaou birbirinin  tamamlayıcısı olan  ve en çok yarar sağlayan boya tipleridir. Diff Quik, yaymaların hemen değerlendirilebilmesini sağlar, zemini korur, fibröz bağ dokusu metakromazisini  ve eozinofillerin oranj granüllerini vurgular. Papanicolaou,  nükleus ve sitoplazma hakkında detaylı bilgi sağlar ve gerektiğinde yayma soldurularak immünositokimyasal boyalar için kullanılabilir.

Back to top

İİS materyal yönetimi ve yardımcı teknikler

Diagnostik mateyalin yönetimi diagnostik sitoloji için, özellikle de lenf nodu sitopatolojisi için, çok önemli bir noktadır; mükemmel yaymalar ve bunların hemen değerlendirilmeleri doğru ve kesin tanı için ilk adımlardır. Kesin tanı için yardımcı teknikler gereklidir ve non-Hodgkin lenfoma (NHL) olguları için vazgeçilmezdir. Her şeye rağmen bu tekniklerin hepsi temel sitoloji laboratuvarlarında elde hazır değildir ve her birinin kendine has uygulamaları vardır. Aslında, NHL tanısı ve sınıflandırması için son derece yararlı bilgi sağlayan İİAS, Hodgkin lenfoma (HL) ve metastazların tanısında uygun değildir. Tersine, İSK morfolojik detaylar ve immünofenotipik özelliklerin birleşimiyle HL ve metastazların tanısında yüksek oranda katkı sağlarken, hafif zincir değerlendirmesinde ya da T-zengin B-hücreli NHL tanımlanmasında daha az etkili olabilir. FISH, spesifik NHL antitelerinin tanımlanmasında çok etkilidir fakat genellikle sadece öngörülen  tanısal oryantasyonda kullanılır. Bu sorunlar, İİAS materyalinin genel olarak azlığı ve teknik kaynakların verimli kullanımının gerekliliği aşağıdaki algoritmayı önermiştir.

Yardımcı tekniklerin çoğu, lenf nodu İİS de tanı ve sınıflandırma için vazgeçilmezdir. Her biri spesifik bilgi sağlayabilir ve klinik veriler ile sitolojik özellikler birlikte göz önünde tutularak kullanılmalıdır.

 

Back to top

Sitospin

'Hub' da kalan  ve/veya ikinci geçişte elde edilen materyal  pH 7.4’lük tampon bir solüsyonda süspanse edilebilir. immünositokimya için kullanılabilecek altı ya da yedi sitospin hazırlamak için, tek bir geçişte kolaylıkla  elde edilebilecek, bir veya iki milyon hücre gereklidir. Havada kurumuş sitospinler oda sıcaklığında 1 haftaya kadar saklanabilir; daha uzun süreler ( 1-2 yıl) için -20°de saklanmaları gerekir. Hem immünoalkali fosfataz hem de immünoperoksidaz sitospin üzerinde kullanılabilir.

Back to top

Hücre Bloğu

Hücre blokları, santrifüj edilmiş  hücre süspansiyon çökeltilerinin parafine gömülmesiyle hazırlanabilir; formalin tesbitli hücre süspansiyonları için Cytoblock kasetleri kullanılabilir. Hücre bloklarının ana avantajları çok sayıda kesit elde edilebilmesi, uzun süre saklanabilmeleri ve formalin tespitli histolojik kesitlerle aynı antijenik özellikte olmalarıdır.

Back to top

İmmünositokimya (İSK)

Etanol tespitli yaymalar veya hücre bloklarından elde edilen  ksilenle  deparafinize ve alkolle rehidrate edilmiş parafin kesitler bu amaç için kullanılabilir. Lamlar 0.01 M tri-sodium sitrat solüsyonuyla dolu şalelere yerleştirilir ve mikrodalgada 5’er dakika 3 kez ısıtılır. Isıtmanın ardından lamlar;  ılık, akan suda 5 dakika ve sonrasında ph 7.4  Tris-Buffer Salin  (TBS) ile yıkanır. Primer Ab ile inkübasyonun ardından, lamlar biotinilize anti-mouse veya anti-rabbit immünoglobulinlerle kaplanır, peroksidaz işaretli streptavidini (LSAB) takiben 10 dakika Horse Peroxidase Enzime (HRP) inkübasyonundan sonra kromojen olarak diaminobenzidine (DAB) kullanılarak sinyal geliştirilir.

Back to top

Akım sitometrisi (AS)

İğne haznesinde kalan ya da ek iğnelemelerle  elde edilen materyal  RMPI-1640 veya pH 7.4’de tampon solüsyonda süspanse edilebilir.  Tek geçişle toplanabilecek bir ya da iki milyon hücre, temel floresan panel antikorları için altı tüpe dağıtılır. Bunlar çifte laser instrumanı kullanılarak farklı florokromlarla konjuge edilmiş  üç veya dört antikor grubuyla kullanılır. Floresenize antikor konjugasyonu zamanında uygulanmalıdır zira süspansiyondaki vital hücreler şişebilir. Konjugasyon sonrasında hücre şişmesi bir damla tamponlanmış formalin eklenerek tespitle engellenebilir, böylece analiz ertelenebilir veya tekrarlanabilir. İİAS’nin avantajları: direkt antijen-antikor reaksiyonu, antijen ekspresyonunun tam sayımı , aynı hücrelerde iki farklı antikorun ko-ekspresyonudur. Dezavantajları  ise morfolojinin yokluğu, büyük hücrelerin kaybı, sayısal olarak az hücre popülasyonlarının tanımlanma güçlüğü.

Back to top

Floresan in situ hibridizasyon (FISH)

Spesifik DNA segmentlerini vizüalize etmek için floresenize DNA probları kullanılır. Kromozom anomalileri, yani translokasyonlar ve delesyonlar gözlenebilir ve ölçülebilir. FISH yaymalar veya sitospinler üzerinde uygulanabilir. Sitospin kullanımının avantajları: yüksek hücre konsantrasyonu, prob tasarrufu ve kısa analiz süresidir.

Back to top

Polimeraz zincir reaksiyonu

Aspire hücreler,  hem RNA hem de DNA prezervasyonu ve ekstraksiyonu için RNAlater® içinde süspanse edilebilir. DNA ekstraksiyonuna kadar hücreler oda sıcaklığında saklanabilir. DNA segmentleri  oligonükleotid probları ve polimeraz enzimleriyle tekrarlayan denatürasyon, 'annealing' ve ekstansiyon  döngüleriyle amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri jel elektroforez veya kapiller elektroforez ile analiz edilebilir. Ig zincirlerinin JH lokusü veya Tc reseptörü amplifiye edilebilir ve monoklonalite veya poliklonalite için değerlendirilebilir.

Back to top