Κυτταρολογία Υγρής Φάσης

Αρχές της Kυτταρολογίας Υγρής Φάσης (LBC) για την προετοιμασία των επιχρισμάτων Ένα δείγμα κυττάρων συλλέγεται από τον τράχηλο με τον κανονικό τρόπο      χρησιμοποιώντας μια σπάτουλα ή ψήκτρα ως συσκευή δειγματοληψίας Το δείγμα μεταφέρεται σε ένα φιαλίδιο με συντηρητικό υγρό μέσο μεταφοράς Τα κύτταρα διασκορπίζονται στο υγρό Ένα υποπολλαπλάσιο του διαθέσιμου υλικού επιλέγεται για την επεξεργασία Τα κύτταρα χωρίζονται με φυγοκέντριση ή φιλτράρισμα και κατατίθενται σε μια γυάλινη επιφάνεια (πλακίδιο) ως λεπτό στρώμα , μίας στιβάδας κυττάρων, με ιζηματοποίηση ή εφαρμογή πίεσης Τα επιχρίσματα βάφονται, επικαλύπτονται και ετοιμάζονται για τη μικροσκόπηση

Υπάρχουν διάφορα συστήματα που είναι διαθέσιμα. Αυτά που χρησιμοποιούνται ευρέως είναι:

• Το Sure Path (AutoCyte, TriPath Imaging)
• Το Thin Prep (CYTYC)

View Surepath Processing system

View Thinprep 2000 processor (CYTYC)

Κύρια χαρακτηριστικά των συστημάτων Surepath και Thinprep

• Κατάλληλη συσκευή για τη λήψη των δειγμάτων από τον τράχηλο της μήτρας για LBC θεωρείται η ψήκτρα. Η συσκευή περιστρέφεται 5 φορές γύρω από το τραχηλικό στόμιο με δεξιόστροφη κατεύθυνση.
• Το κεφάλι της ψήκτρας αφαιρείται και τοποθετείται στο φιαλίδιο που περιέχει μονιμοποιητικό υλικό(SurePath) ή ξεπλένεται με δύναμη στο μέσο μεταφοράς στο φιαλίδιο που περιέχει το μονιμοποιητικό (ThinPrep).
• Τα κύτταρα απομακρύνονται από το αιώρημα με φυγοκέντριση (Surepath) ή διήθηση (ThinPrep)
• Τα κύτταρα κατατίθενται στο πλακίδιο(slide) σε μια οβάλ ή κυκλική περιοχή με την ιζηματοποίηση (Surepath) ή την ελεγχόμενη πίεση (ThinPrep)
• Η περιοχή για τη μικροσκόπηση έχει διάμετρο 13 χιλ. (Surepath) ή 20mm (Thin Prep)
• Και το Surepath και το ThinPrep σύστημα είναι αυτοματοποιημένα

Σύγκριση της συλλογής και προετοιμασίας του συμβατικού επιχρίσματος με το επίχρισμα της κυτταρολογίας υγρής φάσης:

Προετοιμασία συμβατικού επιχρίσματος
Προετοιμασία επιχρίσματος κυτταρολογίας υγρής φάσης

Πλεονεκτήματα της κυτταρολογίας υγρής φάσης

• Άμεση μονιμοποίηση με αποτέλεσμα την βελτίωση της ανάδειξης των λεπτομερειών στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα
• Όλο το υλικό που συλλέχθηκε είναι διαθέσιμο για μικροσκοπική αξιολόγηση
• Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα προετοιμάζεται για την κυτταρολογική αξιολόγηση, αλλά πολλαπλάσια δείγματα μπορούν να προετοιμαστούν ανάλογα με τις ανάγκες
• Καθαρότερο υπόστρωμα , έτσι ώστε τα ενδιαφέροντα επιθηλιακά κύτταρα είναι λιγότερο πιθανό να καλυφθούν
• Ένα λεπτό στρώμα των διασκορπισμένων κυττάρων είναι απλωμένο σε μια σταθερή περιοχή. Έτσι η περιοχή που καλύπτεται είναι μικρή, και ο χρόνος που απαιτείται για να εξεταστεί είναι μικρότερος από αυτόν που απαιτείται για να εξεταστεί ένα συμβατικό επίχρισμα.
• Μειώνεται το ποσοστό των ανεπαρκών αποτελεσμάτων.
• Τα δείγματα LBC είναι κατάλληλα και για άλλες εξετάσεις π.χ. HPV τεστ.
• Τα επιχρίσματα της LBCείναικατάλληλαγιααυτοματοποιημένηανάλυση

Μειονεκτήματα της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης (LBC)

• Τα σχέδια του επιχρίσματος αλλάζουν λόγω της τυχαιοποίησης των κυττάρων
• Τα άτυπα κύτταρα είναι διασκορπισμένα
• Τα δείγματα LBC που έχουν λίγα κύτταρα είναι δύσκολο να ελεγχθούν και να ερμηνευτούν
• Η βλέννη, το αίμα, η φλεγμονή και η κακοήθης διάθεση υπάρχουν ακόμη, αλλά εμφανίζονται ελαφρώς διαφορετικά
• Τα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζονται συνήθως μεμονωμένα και είναι ελαφρώς μικρότερα από ότι εμφανίζονται στα συμβατικά επιχρίσματα, ειδικά τα ενδοτραχηλικά και τα ανώριμα μεταπλαστικά κύτταρα.
• Η LBC είναι ακριβότερη από τη συμβατική εξέταση.

Επάρκεια των δειγμάτων LBC

Σε όλες τις δημοσιευμένες μελέτες στη Μεγάλη Βρετανία, το ποσοστό ανεπαρκών επιχρισμάτων μειώνεται από την εισαγωγή της LBC, αν και τα αποτελέσματα των διεθνών μελετών των ποσοστών ανεπάρκειας είναι ποικίλα. Αυτός είναι ο σημαντικότερος παράγοντας στην απόφαση της Μεγάλης Βρετανίας να μετατρέψει τα συμβατικά κολποτραχηλικά επιχρίσματα σε LBC. Το σημαντικό ζήτημα ανησυχίας που πρέπει να διευκρινιστεί είναι εάν η μείωση του ποσοστού των ανεπαρκών είναι ασφαλής. Μετατρέπουμε τα ανεπαρκή επιχρίσματα σε αρνητικά επαρκή ή χάνουμε περισσότερα άτυπα επιχρίσματα από αυτήν την μείωση ποσοστού; Είναι σαφές ότι  περαιτέρω εργασία απαιτείται επάνω στα κριτήρια για τον καθορισμό της επάρκειας ενός LBC επιχρίσματος. Αναγνωρίζεται ότι τα τρέχοντα κριτήρια επάρκειας για τα συμβατικά τεστ Παπανικολάου ποικίλουν μεταξύ των εργαστηρίων,μεσυνέπειατηφτωχήτυποποίησηαυτήςτηςδιαγνωστικήςκατηγορίας

 

Τα κριτήρια Bethesda για τον προσδιορισμό της επάρκειας των δειγμάτων LBC

• Οποιοδήποτε δείγμα με άτυπα κύτταρα είναι εξ ορισμού ικανοποιητικό για αξιολόγηση.
• Ένα ελάχιστο 5.000 πλακωδών κυττάρων, καλά διατηρημένων, πρέπει να υπάρχει στο επίχρισμα.
• Ένα ελάχιστο 10 οπτικών πεδίων (μεγέθυνση x40) πρέπει να μετρηθεί συνήθως κατά μήκος μιας διαμέτρου που να περιλαμβάνει το κέντρο του επιχρίσματος.
• Επιχρίσματα με λιγότερα από 5000 κύτταρα πρέπει να εξεταστούν για να εξακριβωθεί η αιτία.
• Ο μέσος αριθμός κυττάρων, ανά μικροσκοπικό οπτικό πεδίο ,για να επιτευχθεί ο αριθμός των 5000 κυττάρων, παρουσιάζεται στον ακόλουθο πίνακα. Εάν υπάρχουν υποκυτταρικές ή κενές περιοχές στο επίχρισμα το ποσοστό των υποκυτταρικών περιοχών πρέπει να υπολογιστεί.

 

Οδηγίες για τον υπολογισμό της κυτταροβρίθειας στα επιχρίσματα της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης (Αναφ. Το Σύστημα Bethesda 2001)

Ταχεία μέθοδος αξιολόγησης της κυτταροβρίθειας 1

Ταχεία μέθοδος αξιολόγησης της κυτταροβρίθειας 2

Τροποποιήσεις της μορφολογίας των κυττάρων στην Κυτταρολογία Υγρής Φάσης

Η κύρια επίδραση των LBC δειγμάτων στην μορφολογία των επιθηλιακών κυττάρων είναι:

• Χάνονται οι σχέσεις μεταξύ των κυττάρων και τα κύτταρα είναι τυχαία διασκορπισμένα
• Διασπορά των άτυπων κυττάρων
• Λίγες επίπεδες ομάδες μπορεί να είναι δύσκολο να εξεταστούν και να αξιολογηθούν

Αυτά απεικονίζονται στις ακόλουθες εικόνες

Γενική εικόνα επιχρίσματος

The overall smear pattern is eliminated – but cell architecture and contextual background similar to that found in a conventional smear. The background pattern is cleaner than in conventional smears making it easier to identify normal and abnormal cells. Blood mucous inflammatory exudate and necrotic debris can still be recognised although they look a little different from conventional smears; the so called “tumour diathesis” can still be recognised in LBC preparation.

 

Inadequate LBC	Adequate LBC

Squamous epithelial cells

The general morphology of epithelial cells is preserved although they mainly appear as single cells. Clumps and sheets of epithelial cells are generally smaller than those seen in conventional smears Endocervical and immature metaplastic cells may appear slightly smaller.The chromatin may appear more granular but should show an even distribution.The nuclear membrane is usually smooth but may be folded

Endocervical cells

The typical honeycomb appearance can still be seen but isolated cells and cells in palisade also found. Bare nuclei less frequent in LBC preparations.Nuclei appear crisper and chromatin more granular.Cilia and mucous vacuoles in the cytoplasm may also be seen. Occasionally the cells may be rounded up or twisted due to processing artifact.

Immature metaplastic cells

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

 

Τα κύτταρα του ενδομητρίου συχνά είναι καλά διατηρημένα στα LBC επιχρίσματα αντίθετα από τα συμβατικά επιχρίσματα όπου εμφανίζονται συχνά μάλλον εκφυλισμένα. Εμφανίζονται σε τρισδιάστατες ομάδες ή κυτταρικές σφαίρες, αλλά μπορούν επίσης να βρεθούν μεμονωμένα. Οι πυρήνες είναι στρογγυλοί ή ωοειδείς, μικροί, ακόμα και υπερχρωματικοί. Δεδομένου ότι το αίμα έχει υποστεί λύση στα δείγματα LBC, μόνο ερυθρά αιμοσφαίρια «φαντάσματα» (ghost red cells) υπάρχουν στα εμμηνορροϊκά δείγματα. Ιστιοκύτταρα και κυτταρικά υπολείμματα  μπορούν να βρεθούν.

• Το αίμα έχει υποστεί λύση στα δείγματα LBC, μόνο ερυθρά αιμοσφαίρια «φαντάσματα» (ghost red cells) υπάρχουν στα εμμηνορροϊκά δείγματα.
• Τα κύτταρα βρίσκονται σε τρισδιάστατες διαυγείς ομάδες.
• Η κοκκώδης χρωματίνη και οι πτυχές της πυρηνικής μεμβράνης γίνονται καλύτερα αντιληπτές

Εγκυμοσύνη

Immature metaplastic  cells may appear smaller in LBC preparations giving the false impression of increased nuclear cytoplasmic ratio. However the smooth nuclear outline, even granular chromatin , occasional small round nucleolus and dense cytoplasm will confirm the benign nature of these cells.

View LBC image library

Αξιολόγηση της LBC στην Αγγλία – Πειραματικές μελέτες

• Τον Ιούνιο του 2000, το Εθνικό Ιδρυμα για την Διάκρισης της Κλινικής πράξης (National Institute for Clinical Excellence) εξέδωσε οδηγίες σχετικά με τη χρήση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον προληπτικό έλεγχο του τραχήλου της μήτρας.
• Δήλωσε ότι η LBC θα μπορούσε να παρέχει σημαντικά οφέλη, αλλά η ποιότητα των αποτελεσμάτων από τις μελέτες δεν ήταν σταθερή, και παρέμειναν τομείς που τους χαρακτηρίζει η ασάφεια.
• Ένα πρόγραμμα πειραματικής εφαρμογής της LBC προτάθηκε, με πλήρη επανεξέταση των αποτελεσμάτων σε κάθε στάδιο.
• Αυτές οι εργασίες προοριζόταν να αξιολογήσουν όλα τα αποτελέσματα, δηλ. τις δαπάνες και τις πρακτικές επιπτώσεις της εισαγωγής της LBC στο πρόγραμμα του προληπτικού ελέγχου του τραχήλου της μήτρας.
• Οι κατασκευαστές των δύο συστημάτων, ThinPrep® (Cytyc® Corpotation, Marlborough, MΑ, USA) και SurePath ™ (Tripath Imaging® Inc, Burlington NC, USA) εφάρμοσαν τα  συστήματά τους ώστε να μελετηθούν πειραματικά και τρεις περιοχές χρησιμοποιήθηκαν. Οι δύο χρησιμοποίησαν το ThinPrep® και η τρίτη χρησιμοποίησε το SurePath™.
• Οι μελέτες ξεκίνησαν το 2001-2 και 250.000 δείγματα εξετάστηκαν (και περίπου 12.500 HPV εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα από την προηγούμενη περίοδο που χρησιμοποιούσε τη συμβατική κυτταρολογία.
• Υπολογίστηκαν τα αποτελέσματα των εργαστηριακών δαπανών, συμπεριλαμβανομένου του εξοπλισμού, των αναλώσιμων και της παραγωγικότητας του προσωπικού. Έγινε επίσης αξιολόγηση των δαπανών και της αποτελεσματικότητας της HPV εξέτασης στην αντιμετώπιση των γυναικών, όπως και τα ψυχολογικά αποτελέσματα στις γυναίκες με ανεπαρκή αποτελέσματα από την κυτταρολογική εξέταση και θετικά αποτελέσματα από την HPV εξέταση.

Αποτελέσματα της πειραματικής μελέτης της LBC στην Αγγλία

• Η εισαγωγή της LBC οδήγησε σε μια σαφή μείωση του αναφερόμενου ποσοστού των ανεπαρκών αποτελεσμάτων (από 9% έως 1 - 2%). Το ποσοστό των ανεπαρκών αποτελεσμάτων της πειραματικής μελέτης ήταν χαμηλότερο στην περιοχή που χρησιμοποίησε το SurePath™ από ότι σε εκείνες που χρησιμοποίησαν το ThinPrep™.
• Δεν υπήρξε καμία σαφής ένδειξη για οποιαδήποτε επίδραση της LBC στα ποσοστά ανίχνευσης των borderline (ASCUS) ή της ήπιας δυσκαρίωσης (LSIL), ή για γενική επίδραση, σε όλες τις περιοχές, στα ποσοστά μέτριας και σοβαρής δυσκαρίωσης.
• Υπήρξαν κάποια στοιχεία που φανέρωναν την επίδραση - καμπή εκμάθησης -  κατά τη διάρκεια των πρώτων δύο μηνών της πειραματικής μελέτης, με υψηλότερα ποσοστά borderline και ήπιας ή μέτριας δυσκαρίωσης.
• Υπήρξε μια μείωση του ποσοστού των επιχρισμάτων που αναφερόταν ότι παρουσίαζαν νεοπλασία του αδενικού επιθηλίου.
• Δεν είναι δυνατό να υπολογιστεί η ευαισθησία άμεσα από τις πειραματικές μελέτες, δεδομένου ότι για να γίνει αυτό, απαιτείται η γνώση των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Εντούτοις τα αποτελέσματα για τα ποσοστά μέτριας  και σοβαρής δυσκαρίωσης και τα προσωρινά αποτελέσματα της Προγνωστικής Αξίας των Θετικών αποτελεσμάτων υποδεικνύουν ότι, η ευαισθησία δεν είναι χαμηλότερη με την LBC από ότι με τη συμβατική κυτταρολογία.
• Η παραγωγικότητα των εργαστηρίων αυξήθηκε με την LBC επειδή περισσότερα επιχρίσματα μπορούν να εξεταστούν ανά ώρα κατά τον πρωτοβάθμιο έλεγχο, ενώ ο αριθμός των διαλειμμάτων παρέμεινε αμετάβλητος.
• Η μείωση του ποσοστού των ανεπαρκών αποτελεσμάτων με την χρήση της LBC θα μειώσει τις γενικές δαπάνες, καθώς λιγότερα επιχρίσματα πρέπει να ληφθούν, να επεξεργαστούν και να εξεταστούν. Παραδείγματος χάριν, με μια μείωση του ποσοστού των ανεπαρκών επιχρισμάτων από 9% σε 1.6%, ένα εργαστήριο που επεξεργαζόταν προηγουμένως 30.000 επιχρίσματα ετησίως, θα έχει μια μείωση στον φόρτο εργασίας, 2.220 επιχρίσματα το χρόνο. Σε εθνικό επίπεδο, ο φόρτος εργασίας θα μειωνόταν από 4.2 εκατομμύρια επιχρίσματα το χρόνο σε 3.9 εκατομμύρια επιχρίσματα το χρόνο.

Αξιολόγηση της LBC σε άλλες χώρες

• Τα εθνικά προγράμματα ελέγχου του τραχήλου της μήτρας είναι σύνθετα. Οι διάφορες χώρες έχουν διαφορετική πολιτική προληπτικού ελέγχου. Κατά συνέπεια τα αποτελέσματα της εφαρμογής της LBC θα είναι διαφορετικά. Η Αυστραλία, η Νέα Ζηλανδία, η Γερμανία, η Γαλλία, η Ολλανδία και η Σκωτία έχουν αξιολογήσει πρόσφατα την LBC και έχουν καταλήξει σε διαφορετικά συμπεράσματα.
• Η Σκωτία εφαρμόζει την LBC
• Η Αυστραλία και η Νέα Ζηλανδία έχουν αποφασίσει να μην υποστηρίξουν την LBC με τη δημόσια χρηματοδότηση αυτή τη στιγμή.
• Η Γερμανική Κυτταρολογική Εταιρία έχει ζητήσει περαιτέρω μελέτες, και η Γαλλική έκθεση δεν έχει δημοσιευτεί ακόμα.
• Επειδή τα σχήματα στα επιχρίσματα είναι τροποποιημένα στα επιχρίσματα της LBC, η εκπαίδευση είναι ουσιαστική πρίν αναλάβει κανείς την εξέταση αυτών των δειγμάτων.
• Αυτήν την περίοδο οι εμπορικές εταιρίες προσφέρουν εκπαίδευση κατάρτισης τριών ημερών.
• Ο στόχος του προγράμματος είναι να εκπαιδευθούν οι εκπαιδευτές
• Οι συμμετέχοντες κυτταροτεχνολόγοι αναμένονται να επιστρέψουν στο εργαστήριό τους για να διδάξουν ολόκληρο το εργαστηριακό προσωπικό.
• Οι κυτταροτεχνολόγοι πρέπει να επιτύχουν ευαισθησία 95% για τις HSIL αλλοιώσεις, πρίν αναλάβουν την εξέταση των LBC δειγμάτων.

 

Αλλαγές στην πρακτική εργασίας (αξιολόγηση της LBC στην Αγγλία)

• Η προετοιμασία δειγμάτων με χρήση της LBC βασίζεται σε μηχανές που προετοιμάζουν μεταξύ 25 000 και 80 000 δείγματα το χρόνο. Τα προτεινόμενα πρότυπα για τον εκσυγχρονισμό της κυτταροπαθολογίας, που βασίζονται στον χειρισμό του διαδυκτίου, θα ταίριαζαν καλά με τις μηχανές αυτού του μεγέθους, που επιτρέπουν τη συγκεντρωμένη επεξεργασία των δειγμάτων, με εξέταση και υποβολή εκθέσεων των επιχρισμάτων, στα νοσοκομεία όπου εργάζεται το προσωπικό του προληπτικού ελέγχου.  
• H FDA ενέκρινε την αυτοματοποιημένη εξέταση που είναι διαθέσιμη σήμερα για τα συμβατικά επιχρίσματα Παπανικολάου και εάν εφαρμοστεί στην κλινική πράξη στην Μεγάλη Βρετανία, θα μπορέσει να μειώσει σημαντικά τον εργαστηριακό φόρτο εργασίας και τις εκκρεμότητες.

LBC και HPV εξέταση

• Η εισαγωγή της επιλογής και κατάταξης των περιπτώσεων σε κατηγορίες με σκοπό την κατάλληλη αγωγή ανάλογα με τη σοβαρότητα της κατάστασης βασισμένη στα αποτελέσματα της HPV εξέτασης οδήγησε σε μια μείωση 72% του ποσοστού επανάληψης των επιχρισμάτων αλλά υπερδιπλασίασε το ποσοστό παραπομπών για κολποσκόπηση των γυναίκες, έναντι της τρέχουσας πολιτικής.
• Λαμβάνοντας υπόψη την έλλειψη οριστικών αποδεικτικών στοιχείων για την ευαισθησία της εξέτασης του HPVDNA στην μεγάλη Βρετανία, και του αντίκτυπου στη παραπομπή για κολποσκόπηση που παρατηρείται στις πειραματικές μελέτες, συστήνεται προσοχή αυτή τη στιγμή, στην εφαρμογή της  HPV εξέτασης στις γυναίκες, που θα έχει στόχο την επιλογή και κατάταξη των περιπτώσεων σε κατηγορίες, με σκοπό την κατάλληλη αγωγή ανάλογα με τη σοβαρότητα της κατάστασης, παρά τα πολύ υποσχόμενα αποτελέσματα για  μείωση των δαπανών.

Συμπεράσματα

• Τα στοιχεία μέχρι σήμερα, προτείνουν ότι οι κύριοι λόγοι για την εφαρμογή της LBC είναι η βελτιωμένη παραγωγικότητα στα πλαίσια του προγράμματος προληπτικού ελέγχου με τη μείωση του ποσοστού των ανεπαρκών αποτελεσμάτων, με την αύξηση της εργαστηριακής παραγωγικότητας και με την μελλοντική δυνατότητα για αυτοματοποίηση και βοηθητικές εξετάσεις (αν και τα τελευταία δεν εξαρτώνται από τη χρήση της).
• Η Κυτταρολογική Εταιρία έχει ανησυχίες που αφορούν τις  υπάρχουσες αποδείξεις που αφορούν την ευαισθησία και την επάρκεια των επιχρισμάτων (που έχουν επιπτώσεις στην παραγωγικότητα).
• Πρέπει να αναφερθεί ότι η LBC δεν έχει εξεταστεί σε μακροχρόνιες μελέτες στις χώρες που έχουν ορίσει ως κατάλληλο χρόνο επανάληψης της εξέτασης Παπανικολάου τα τρία έως πέντε χρόνια, στα πλαίσια του προγράμματος προληπτικού ελέγχου.
• Είναι σημαντικό ότι η LBC δεν προβάλλεται ως πιό ευαίσθητη μέθοδος από την συμβατική κυτταρολογία.
• Η κατάρτιση πρέπει να είναι η κατάλληλη. Η συντήρηση της πείρας στην εξέταση των συμβατικών τεστ Παπανικολάου να απαιτηθεί.