Liquid based cytology – LBC - cytologie z tekutého média

Principy přípravy preparátů v LBC Buněčný vzorek je získán z hrdla obvyklým stěrem Vzorek je přenesen do kontejneru s transportním/fixačním roztokem Buňky jsou dispergovány v roztoku Část vzorku je zpracována Buňky jsou odděleny centrifugací nebo filtrací a umístěny v tenké vrstvě na podložním skle (monolayer) sedimentací nebo tlakem Preparáty jsou barveny a montovány pro mikroskopické vyšetření

 

V současné době je užíváno několik systémů. Nejčastěji jsou to:

• Sure Path (autocyte, TriPath Imaging)
• Thin Prep (CYTYC)

View Surepath Processing system

View Thinprep 2000 processor (CYTYC)

Hlavní znaky systémů Surepath a Thinprep

•  K odběru vzorků pro LBC se doporučuje kartáček nebo štětička. Nástroj je 5x otočen kolem cervikálního ústí ve směru hodinových ručiček.
• Hlava kartáčku je oddělena a vložena do roztoku s fixativem (SurePath) nebo řádně vymáchána (Thin Prep)
• Buňky jsou ze suspenze odděleny centrifugací (Surepath) nebo filtrací (Thin Prep)
• Buňky jsou umístěny na sklo v oválném nebo okrouhlém poli pomocí sedimentace (Surepath) nebo kontrolovaného tlaku (Thin Prep)
• Pole pro mikroskopii má průměr 13 mm (Surepath) nebo 20mm (ThinPrep)
• Jak Surepath tak Thin Prep systémy jsou automatizované

Porovnání odběru a zpracování konvenčních nátěrů a LBC preparátů:

Příprava konvenčního nátěru
Příprava preparátu z tekutého media

Výhody LBC

• Okamžitá fixace se zlepšením jaderných a cytoplasmatických detailů
• Všechen odebraný materiál je k dispozici pro zpracování
• Zpracován je reprezentativní vzorek, lze však připravit více preparátů
• Čistší pozadí- lepší viditelnost epiteliálních buněk
• Tenká vrtsva a konstantní rozsah pozorovaného pole snižují čas nutný pro screening oproti konvenčním nátěrům
• Podíl nereprezentativních preparátů klesá
• LBC vzorky jsou vhodné pro doplňkové testy, např. HPV testing
• LBC vzorky jsou vhodné pro automatizovanou analýzu

Nevýhody LBC

• Obrazce z nátěrů jsou rozrušeny randomizací buněk
• Abnormální buňky jsou roztroušeny
• Řídké LBC preparáty jsou obtížně interpretovatelné
• Krev, hlen, zánět a znaky nádorové diatézy jsou do určité míry stále přítomny, ale vypadají poněkud jinak
• Epitelie jsou převážně jednotlivě, vypadají menší než v konvenčních nátěrech – zejm. endocervikální a nezralé metaplastické buňky
• LBC je dražší než konvenční test

Adekvátnost LBC vzorků

Ve všech studiích publikovaných ve Velké Británii poklesl se zavedením LBC podíl neadekvátních vzorků, i když výsledky mezinárodních studií byly variabilní. To bylo rozhodujícím faktorem, zda přejít ve Velké Británii na LBC. Podstatnou otázkou je, zda redukce podílu neadekvátních vzorků je bezpečná. Neměníme neadekvátní vzorky na adekvátní negativní a neztrácíme přitom abnormální nálezy? Je zřejmé že na kriteriích adekvátnosti LBC je třeba ještě pracovat. Je známo, že u konvenčních nátěrů se kriteria adekvátnosti mezilaboratorně liší a tato diagnostická kategorie je obtížně standardizovatelná.

Bethesda kritéria pro určení adekvátnosti LBC vzorků

• Každý vzorek s obsahem abnormálních buněk je adekvátní
• Nejméně 5,000 dobře viditelných/zachovalých dlaždicových buněk na skle
• Nejméně 10 polí by mělo být spočítáno objektivem 40x podél průměru procházejícího centrem preparátu
• Preparáty s méně než 5000 buněk by měly být podrobeny kontrole k určení příčiny

Průměrný počet buněk v zorném poli k dosažení 5000 buněk je ukázán v následující tabulce. Pokud preparát obsahuje hypocelulární nebo prázdná pole, je třeba určit jejich podíl.

Guidelines for estimating the cellularity for Liquid Based Cytology slides (Ref. The Bethesda System 2001)

View rapid method of evaluating cellularity 1

View rapid method of evaluating cellularity 2

LBC změny buněčné morfologie

Hlavní vliv LBC na buněčnou morfologii spočívá v :

• Ztrátě vztahů mezi buňkami a jejich náhodným rozhozením
• Roztroušením abnormálních buněk
• Ŕídké monolayery mohou být obtížné pro screening a interpretaci

To je ilustrováno v následujících preparátech

Celkový vzhled nátěru

Celkový vzhled nátěru je zrušen – nikoli však buněčná architektura a pozadí podobné tomu, které se nachází v konvenčních nátěrech. Pozadí je čistší než v konvenčních nátěrech, což usnadňuje identifikaci normálních I abnormálních buněk. Krev, hlen, zánětlivý exudát a nekrotický detritus jsou rozpoznatelné, I když vypadají poněkud jinak, než v konvenčních nátěrech; tzv. “nádorová diatéza” je v LBC nátěrech rozpoznatelná.

 

Nedostatečná LBC	Dostatečná LBC

Dlaždicové epitelie

Obecná morfologie epitelových buněk je zachována, ačkoli se většinou vyskytují izolovaně. Trsy a plachty epitelových buněk jsou zpravidla menší než v konvenčních nátěrech. Endocervikální a nezralé metaplastické  buňky se jeví menší. Chromatin je výrazněji granulovaný, zůstává však jemný, stejnoměrný. Jaderná membrána je hladká, může být zpřehýbaná.

Endocervikální buňky

Typický je voštinovitý vzhled, ale vyskytují se i izolované buňky a proužky. Nahá jádra jsou v LBC zřídkavější. Jádra jsou výraznější, chromatin zřetelněji granulární. V cytoplazmě mohou být vakuoly hlenu a na povrchu cilie. Buňky mohou být někdy zakulacené nebo zkroucené – artefakty v důsledku zpracování

Nezralé metaplastické buňky

Nezralé metaplastické buňky  se v LBC preparátech zdají menší a vzbuzují tak dojem zvýšeného nukleoplasmatického poměru.  Hladká jaderná konture a jemně granulární chromatin, někdy malé okrouhlé jadérko a denzní cytoplasma potvrzují  benigní povahu těchto buněk.

 

Endometriální buňky jsou často dobře zachovalé v LBC preparátech na rozdíl od konvenčních, kde jsou zpravidla degenerované. Vyskytují se v trojrozměrných trsech nebo koulích, ale mohou být i jednotlivě. Jádra mají kulatá nebo oválná, malá, pravidelná hyperchromní. Protože je krev v LBC lyzována, jsou v mentruačních vzorcích pouze stíny erytrocytů. Mohou být přítomny histiocyty a detritus.

• Krev je v LBC lyzována, proto jsou v mentruačních vzorcích pouze stíny erytrocytů
• Buňky jsou v transparentních trojrozměrných trsech
• Granulární chromatin a membránové záhyby jsou lépe viditelné

Těhotenství

Nezralé metaplastické buňky  se v LBC preparátech zdají menší a vzbuzují tak dojem zvýšeného nukleoplasmatického poměru.  Hladká jaderná konture a jemně granulární chromatin, někdy malé okrouhlé jadérko a denzní cytoplasma potvrzují  benigní povahu těchto buněk.

Prohlídka knihovny LBC ilustrací

Hodnocení LBC v anglických pilotních studiích

• V červnu 2000 vydal National Institute for Clinical Excellence(NICE) směrnice pro použití LBC v cervikálním screeningu.
• Konstatoval, že LBC má významné výhody, ale důkazy jsou kolísavé a zůstávají určité nejistoty
• Byl navržen program pilotní implementace LBC s plnou kontrolou v každém kroku
• Tyto projekty měly vyhodnotit veškeré účinky, náklady, a praktické důsledky zavedení LBC do cervikálního screeningového programu.
• Výrobci dvou systémů - ThinPrep® (Cytyc® Corporation, Marlborough, MA, USA) a SurePath ™ (Tripath Imaging® Inc., Burlington, NC, USA) požádaly o zapojení jejich systémů; na dvou místech byl použit ThinPrep®, na jednom SurePath™.
• Pilotní studie probíhaly v letech 2001-2 a bylo zpracováno 250,000 vzorků (a provedeno přibližně 12500 HPV testů). Výsledky byly srovnány s obdobnými z předchozího období, kdy byly vyšetřovány konvenční nátěry.
• Vliv na laboratorní náklady zahrnující vybavení, spotřební materiál a produktivitu zaměstnanců byly kalkulovány včetně efektivity HPV třídění a psychologického efektu u žen s neodpovídajícím výsledkem nátěru a pozitivním testem HPV .

Výsledky pilotní studie LBC v Anglii pokr.

• Zavedení LBC snížilo zřetelně podíl neadekvátních vzorků (z 9% na 1 – 2%). Podíl neadekvátních byl nižší v laboratořích užívajících SurePath™ než těch , které užívaly ThinPrep™.
• Nebyl doložen žádný vliv LBC na záchyt hraničních nálezů nebo mírné dyskaryózy, ani vliv na záchyt střední a těžké dysplazie.
• Byl prokázán určitý efekt “nácvičné křivky” s vyšším podílem hraničních a low grade nálezů v průběhu prvních dvou měsíců.
• Došlo k poklesu hlášených glandulárních neoplazií.
• Senzitivitu nelze posoudit z pilotních studií, protože chybí údaje o falešně negativních nálezech. Nicméně podíl hlášených středních a těžkých dysplazií a předběžné výsledky pozitivní predikční hodnoty indikují shrnutím výsledků ze všech míst citlivost srovnatelnou  s metodou konvenční cytologie.
• Produktivita laboratoří zavedením LBC stoupla screenováním většího počtu preparátů za hodinu; rozsah pracovních přestávek zůstal zachován.
• Redukce neadekvátních vzorků v  LBC snižuje náklady screeningu zpracováním menšího počtu preparátů. Například redukce neadekvátních nátěrů z 9% na 1.6% znamená pro laboratoř, která ročně zpracuje 30,000 nátěrů redukci pracovního výkonu o 2,220 skel ročně. V celonárodním měřítku by to znamenalo pokles pracovní zátěže ze 4,2 milionu preparátů ročně na 3,9 milionu.

Hodnocení LBC z jiných zemí

• Národní cervikální screeningové programy jsou komplexní a multidisciplinární. Různé země mají různé screeningové intervaly a postupy. Vliv zavedení LBC bude proto v každé zemi jiný.  12 laboratoří v Austrálii, 3 na Novém Zélandu, 11 v Německu, 7 ve  Francii, 20 v Holandsku a 8 ve Skotsku vyhodnotilo LBC a dospělo k různým závěrům.
• Skotsko zavádí LBC
•  Austrálie a Nový Zéland se rozhodly nepodpořit LBC z veřejných zdrojů
• Německá Cytologická společnost doporučila další studie a francouzské výsledky nejsou dosud puiblikovány.
• Protože obrazy v LBC jsou odlišné, před zahájením provozu s LBC  se musí screeneři i patologové interpretaci učit.  
• Současní výrobci nabízejí třídenní přeškolení
• Cílem je školit školitele
•  Cytologové, kteří absolvují třídenní kurs mají následně vyškolit celou laboratoř
• Cílem je pro cytotechnology dosáhnout  95% citlivosti v záchytu HSIL před zahájením rutinního provozu s LBC

Změny v pracovním procesu (Vyhodnocení LBC v Anglii  pokr.)

• Příprava preparátů LBC probíhá v přístrojích, které zpracují ročně 25 000 až 80 000 vzorků. Navrhované modely modernizace patologie založené na řízených sítích budou dobře kompatibilní s přístroji této velikosti umožňujícími centralizované zpracování vzorků  jejichž hodnocení může i nadále probíhat  v nemocnicích , v nichž je současně screenerský personál zaměstnán.
• FDA schválený automatizovaný screening je v současné době dostupný pro konvenční nátěry a pokud bude zaveden do praxe ve Velké Británii, může významně snížit laboratorní zátěž a nedodělky.

LBC a screening HPV

• Zavedení třídění podle výsledku HPV vedlo k 72% redukci opakovaných vyšetření, ale více než zdvojnásobilo indikace ke kolposkopii oproti předchozímu postupu.
• Vzledem k chybějícím údajům o citlivosti HPV DNA analýzy z Velké Británie a vlivu na nárůst kolposkopií, je třeba zaujmout při zavádění testace HPV  jako třídícího postupu zdrženlivý postoj, i když výsledky jsou slibné.

Závěry

• Současné výsledky dokládají, že zavedení LBC je opodstatněno hlavně zlepšenou produktivitou ve screeningovém programu, jak redukcí neadekvátních vzorků, tak zvýšením produktivity práce v laboratoři a také následným potenciálem pro automatizaci a dodatečné testy.
• Společnost patologů podržuje rezervovaný vztah k dostupným důkazům senzitivity a adekvátnosti (které ovlivňují produktivitu).
• Je třeba podotknout, že LBC nebyla testována v žádné longitudinální studii v zemích s tří až pětiletým screeningovým programem.
• Je zásadní, aby LBC nebyla přeceňována jako citlivější než současný screening.
• Náklady na výcvik musí být správně rozloženy. I nadále bude vyžadována schopnost hodnocení konvenčních nátěrů.